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一文揭秘镍NTA琼脂糖凝胶的使用操作流程

 发布时间:2022-03-31 点击量:442
   镍NTA琼脂糖凝胶具有特异性好、流速快的优点,颗粒粒度均匀,粒径小,并且螯合镍更稳定,能耐受更高的还原剂,物理和化学稳定性好,批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子,使用更方便。
  镍NTA琼脂糖凝胶在非变性条件下抽提His标签蛋白,其操作流程如下:
  1.准备细胞,接种,诱导表达。收集细胞,置于-70°C或立即进行步骤2操作。
  2.加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1mM现用现加。
  3.将细胞悬浮起来,加入溶菌酶,混匀,冰上放置30分钟,超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
  4.加入10%TritonX-100,使终浓度为0.05%,充分混匀,冰上放置15分钟。
  5.12000rpm/min,4°C离心15分钟以上。取上清,置于冰上备用或-20°C保存。
  6.将NTA树脂装入合适的层析柱,层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗。
  7.将样品加至NTA层析柱中,流速在15ml/h左右,收集穿透部分,用SDS/PAGE分析蛋白的结合情况。
  8.层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗,流速控制在30ml/h左右。
  9.分别用5倍NTA体积的洗脱,流速控制在15ml/h左右,收集洗脱液,每管收集一个NTA体积。
  10.确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。有效的方式是SDS-PAGE分析;也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒,快速确定蛋白质的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
  11.化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
  镍NTA琼脂糖凝胶在位清洗技巧:
  1、除去因离子交换作用吸附的蛋白,用2~3倍柱床体积2MNaCl溶液淋洗柱子,再反向淋洗。
  2、除去蛋白沉淀、疏水性蛋白,用1MNaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1h。
  3、所有操作中,都要用至少3倍柱床体积的初始缓冲液洗柱子。
  4、除去强的疏水性蛋白和脂质等,用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子,再反向淋洗。

镍NTA琼脂糖凝胶